1.項目背景
1.1臨床意義
摘自《25-羥基維生素D檢測試劑注冊技術審查指導原則》
維生素D是一種脂溶性類固醇衍生物，是人體必需的脂溶性維生素，經紫外線照射后可轉化為維生素D2 。人體從食物攝入或在體內合成的膽固醇經轉變為7-脫氫膽固醇并貯存于皮下，經紫外線照射后可轉化為維生素D3 。維生素D主要有維生素D3 （膽鈣化甾醇）和維生素D2 （麥角鈣化甾醇）兩種形式。其水平受很多因素的影響，主要包括紫外線輻射、膳食補充、年齡和肥胖、種族和民族因素等。維生素D本身不具有生物活性，需要發生2次羥基化轉化為生物活性形式。第1次羥基化發生在肝臟，產生25-羥基維生素D，第2次羥基化主要發生在腎臟，產生具有生物活性代謝物1,25-二羥維生素D。當1,25-（OH）2 D足量時，它可進一步在腎臟轉化為24,25-（OH）2 D，最后發生分解代謝。循環中的25-羥基維生素D的半衰期為2-3周。
因此，在醫學上，對血液中25-羥基維生素D的檢測經常被用于確定體內維生素D的含量，血液中25-羥基維生素D的濃度被認為是體現人體維生素D狀態的較佳指標。
1.2小分子雙抗體夾心法
2015年公開專利CN104969067A《維生素D的測定方法及測定用試劑盒》提及小分子夾心法，摘抄部分內容如下。
使用抗體作為具有維生素D親和性的物質的情況下，可以進一步使用二抗。作為二抗，可以為維生素D的抗體（一抗）的一抗部分的抗體，也可以為維生素D及一抗的復合物的抗體。二抗等抗體可以與檢測用物質連接。
2024年公開專利CN117871874A《小分子物質免疫檢測方法》對小分子夾心法的反應原理做了詳細闡述，摘抄部分內容如下。
本發明提出了一種小分子物質免疫檢測方法，其特征在于，包括：（1）將含有小分子物質的樣本、配體、第二抗體和表面活性劑進行反應，得到小分子物質-配體-第二抗體三元復合物，且所述小分子物質-配體-第二抗體三元復合物中小分子物質誘導配體形成至少一個新的構象表位，所述第二抗體可特異性結合所述至少一個新的構象表位，所述表面活性劑可消除所述第二抗體與構象未改變的配體之間的結合；（2）檢測所述小分子物質-配體-第二抗體三元復合物。
樣本中的小分子物質與配體發生特異性結合，得到小分子物質-配體復合物，并且小分子物質-配體復合物中小分子物質誘導配體形成至少一個新的構象表位。小分子物質-配體復合物與第二抗體和表面活性劑反應，第二抗體特異性地與形成新構象表位的配體結合，同時也會與構象未改變的配體產生弱結合。表面活性劑可消除第二抗體與構象未改變的配體之間的結合，得到小分子物質-配體-第二抗體三元復合物。通過檢測三元復合物，可以實現小分子物質檢測。由此，采用雙抗體夾心法可以提高檢測準確性和靈敏度，不同濃度梯度樣本檢測區分度高。同時，減少了篩選高特異性復合物抗體的難度，更有利于小分子物質檢測試劑盒的大規模生產和檢測，應用價值高。
2. 性能表現
針對25-羥基維生素D抗原的檢測（夾心法），西寶生物推出2種抗體及3種解離劑。
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）識別抗原抗體復合物；
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）識別小分子抗原。
具體性能如下（以下評估僅代表在西寶生物的工藝體系下的驗證，建議客戶根據自身工藝進行更為詳細的驗證）。
2.1化學發光（AE）平臺
組合1：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被羧基磁珠+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記吖啶酯；
線性范圍：1.5ng/mL-150ng/mL；最低檢出限：1.5ng/mL。
2.2化學發光（AP）平臺
組合2：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被羧基磁珠+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記堿性磷酸酶；
線性范圍：1.5ng/mL-150ng/mL；最低檢出限：1.5ng/mL。
2.3熒光免疫層析平臺
組合3：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記熒光微球+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）劃膜；
線性范圍：5ng/mL-100ng/mL；最低檢出限：5ng/mL。
3.臨床相關性
3.1化學發光（AE）平臺：
3.1.1 西寶生物發光（AE）平臺25-羥基維生素D抗體配對組合1與質譜法賦值的臨床樣本相關性R2>0.95，相關性良好；
3.1.2西寶生物發光（AE）平臺25-羥基維生素D抗體配對組合1與羅氏診斷的25-羥基維生素D試劑（電化學發光法）賦值的臨床樣本相關性R2在0.90左右，相關性較好。
3.2化學發光（AP）平臺：
3.2.1西寶生物發光（AP）平臺25-羥基維生素D抗體配對組合2與質譜法賦值的臨床樣本相關性R2在0.95左右，相關性良好；
3.2.2西寶生物發光（AP）平臺25-羥基維生素D抗體配對組合2與羅氏診斷的25-羥基維生素D試劑（電化學發光法）賦值的臨床樣本相關性R2＞0.90，相關性較好。
3.3熒光免疫層析平臺：
西寶生物熒光免疫層析平臺25-羥基維生素D抗體配對組合3與羅氏診斷25-羥基維生素D試劑（電化學發光法）賦值的臨床樣本相關性R2＞0.90，相關性較好。
4. 測試方案
4.1化學發光（AE）平臺-抗體配對組合1
樣本:樣品加樣量10ul；
試劑1：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；
試劑3：25-羥基維生素D解離液（發光專用1）（貨號：DCH0207B）/25-羥基維生素D解離液（發光專用2）（貨號：DCH0207A）
注釋：25-羥基維生素D解離液（發光專用1）（貨號：DCH0207B）對質譜法賦值臨床樣本效果較好；
25-羥基維生素D解離液（發光專用2）（貨號：DCH0207A）對羅氏診斷（電化學發光法）賦值臨床樣本效果較好；
反應條件：
第一步：10ul樣本+50ul試劑1+50ul試劑2+80ul試劑3混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入預激發液及激發液，進行測試。
測試使用發光儀器:科斯邁SMART 500S。
4.2化學發光（AP）平臺-抗體配對組合2：
樣本:樣品加樣量10ul/20ul；
試劑1：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；
試劑3：25-羥基維生素D解離液（發光專用1）（貨號：DCH0207B）/25-羥基維生素D解離液（發光專用2）（貨號：DCH0207A）
注釋：25-羥基維生素D解離液（發光專用1）（貨號：DCH0207B）對質譜法賦值臨床樣本效果較好；
25-羥基維生素D解離液（發光專用2）（貨號：DCH0207A）對羅氏診斷（電化學發光法）賦值臨床樣本效果較好；
反應條件：
第一步：10ul/20ul樣本+50ul試劑1+50ul試劑2+80ul試劑3混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，進行測試。
測試使用發光儀器:迎凱Shine i2900。
4.3熒光免疫層析平臺抗體配對組合3：
樣本:加樣量10ul；
反應條件：10ul樣品+100ul 25-羥基維生素D解離液（熒光層析專用）（貨號：DCH0207C）混勻（無需等待解離），上樣，反應時間（10min-15min）；
測試使用熒光儀器:和邁FIC-S100。
5.產品信息
產品名稱 | 貨號 | 推薦配對 |
25 羥基維生素 D（25-OH VD）抗體 | ECY4531B | 25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被羧基磁珠+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記吖啶酯（發光配對組合1） 25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被羧基磁珠+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記堿性磷酸酶（發光配對組合2） 25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記熒光微球+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）劃膜（熒光配對組合3） |
25 羥基維生素 D（25-OH VD）抗體 | ECY4531C | |
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被羧基磁珠濃縮液 | DKY1333A | DKY1333A+ DKY1333B（AE化學發光） |
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）吖啶酯濃縮液 | DKY1333B | |
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記堿性磷酸酶濃縮液 | DKY1333C | DKY1333A+ DKY1333C（AP化學發光） |
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記熒光微球濃縮液 | DKY1333D | DKY1333A+ DKY1333D（免疫熒光層析） |
AMPPD 發光底物液（即用型） | DCD0517A | |
AMPPD 發光底物液（即用型） | DCD0517B | |
羧基磁性微球，1.5um | DEG0800C | |
時間分辨熒光微球，羧基（200nm） | AEG0786B | |
25-羥基維生素D解離液（發光專用1） | DCH0207B | 適合化學發光（質譜法賦值臨床樣本） |
25-羥基維生素D解離液（發光專用2） | DCH0207A | 適合化學發光（羅氏診斷電化學發光法樣本 ） |
25-羥基維生素D解離液（熒光層析專用） | DCH0207C | 適合免疫熒光層析平臺 |
目前，由于維生素D檢測的標準化工作剛剛起步，各種檢測方法間存在著明顯的結果差異，尤其是商業化方法以及不同實驗室的自建方法。
1.液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）作為小分子檢測的金標準，雖然特異性好、準確度高，但其通量小、前處理復雜、對設備和人員要求高，更重要的是出報告時間超過6小時，且無法當天出報告，因此難以廣泛使用。
2.主流化學發光廠家檢測維生素D的主要方法還有競爭法。
3.雙抗夾心法相較于競爭法在靈敏度、特異性和檢測范圍均有明顯優勢，使用小分子夾心法檢測維生素D近年得到了廠商和臨床端越來越多的認可。
西寶生物作為體外診斷上游原料供應商，除上述新開發的夾心法抗原抗體試劑原料，還能提供競爭法相關試劑.詳情如下：
西寶物料 | 產品 | 類型 | 規格 | 建議使用 |
EDD0425A | 25 羥基維生素 D（25-OH-VD3-BSA）抗原 | 包被 | 1mg | CLIA、LF （競爭法） |
ECY4531A | 25 羥基維生素 D（25-OH VD）抗體 | 標記 | 1mg | |
DCH0207B | 25-羥基維生素D解離液（發光專用1） | 100ml | ||
DCH0207A | 25-羥基維生素D解離液（發光專用2） | 100ml | ||
DCH0207C | 25-羥基維生素D解離液（熒光層析專用） | 100ml |
1.項目背景
1.1臨床意義
摘自《25-羥基維生素D檢測試劑注冊技術審查指導原則》
維生素D是一種脂溶性類固醇衍生物，是人體必需的脂溶性維生素，經紫外線照射后可轉化為維生素D2 。人體從食物攝入或在體內合成的膽固醇經轉變為7-脫氫膽固醇并貯存于皮下，經紫外線照射后可轉化為維生素D3 。維生素D主要有維生素D3 （膽鈣化甾醇）和維生素D2 （麥角鈣化甾醇）兩種形式。其水平受很多因素的影響，主要包括紫外線輻射、膳食補充、年齡和肥胖、種族和民族因素等。維生素D本身不具有生物活性，需要發生2次羥基化轉化為生物活性形式。第1次羥基化發生在肝臟，產生25-羥基維生素D，第2次羥基化主要發生在腎臟，產生具有生物活性代謝物1,25-二羥維生素D。當1,25-（OH）2 D足量時，它可進一步在腎臟轉化為24,25-（OH）2 D，最后發生分解代謝。循環中的25-羥基維生素D的半衰期為2-3周。
因此，在醫學上，對血液中25-羥基維生素D的檢測經常被用于確定體內維生素D的含量，血液中25-羥基維生素D的濃度被認為是體現人體維生素D狀態的較佳指標。
1.2小分子雙抗體夾心法
2015年公開專利CN104969067A《維生素D的測定方法及測定用試劑盒》提及小分子夾心法，摘抄部分內容如下。
使用抗體作為具有維生素D親和性的物質的情況下，可以進一步使用二抗。作為二抗，可以為維生素D的抗體（一抗）的一抗部分的抗體，也可以為維生素D及一抗的復合物的抗體。二抗等抗體可以與檢測用物質連接。
2024年公開專利CN117871874A《小分子物質免疫檢測方法》對小分子夾心法的反應原理做了詳細闡述，摘抄部分內容如下。
本發明提出了一種小分子物質免疫檢測方法，其特征在于，包括：（1）將含有小分子物質的樣本、配體、第二抗體和表面活性劑進行反應，得到小分子物質-配體-第二抗體三元復合物，且所述小分子物質-配體-第二抗體三元復合物中小分子物質誘導配體形成至少一個新的構象表位，所述第二抗體可特異性結合所述至少一個新的構象表位，所述表面活性劑可消除所述第二抗體與構象未改變的配體之間的結合；（2）檢測所述小分子物質-配體-第二抗體三元復合物。
樣本中的小分子物質與配體發生特異性結合，得到小分子物質-配體復合物，并且小分子物質-配體復合物中小分子物質誘導配體形成至少一個新的構象表位。小分子物質-配體復合物與第二抗體和表面活性劑反應，第二抗體特異性地與形成新構象表位的配體結合，同時也會與構象未改變的配體產生弱結合。表面活性劑可消除第二抗體與構象未改變的配體之間的結合，得到小分子物質-配體-第二抗體三元復合物。通過檢測三元復合物，可以實現小分子物質檢測。由此，采用雙抗體夾心法可以提高檢測準確性和靈敏度，不同濃度梯度樣本檢測區分度高。同時，減少了篩選高特異性復合物抗體的難度，更有利于小分子物質檢測試劑盒的大規模生產和檢測，應用價值高。
2. 性能表現
針對25-羥基維生素D抗原的檢測（夾心法），西寶生物推出2種抗體及3種解離劑。
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）識別抗原抗體復合物；
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）識別小分子抗原。
具體性能如下（以下評估僅代表在西寶生物的工藝體系下的驗證，建議客戶根據自身工藝進行更為詳細的驗證）。
2.1化學發光（AE）平臺
組合1：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被羧基磁珠+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記吖啶酯；
線性范圍：1.5ng/mL-150ng/mL；最低檢出限：1.5ng/mL。
2.2化學發光（AP）平臺
組合2：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被羧基磁珠+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記堿性磷酸酶；
線性范圍：1.5ng/mL-150ng/mL；最低檢出限：1.5ng/mL。
2.3熒光免疫層析平臺
組合3：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記熒光微球+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）劃膜；
線性范圍：5ng/mL-100ng/mL；最低檢出限：5ng/mL。
3.臨床相關性
3.1化學發光（AE）平臺：
3.1.1 西寶生物發光（AE）平臺25-羥基維生素D抗體配對組合1與質譜法賦值的臨床樣本相關性R2>0.95，相關性良好；
3.1.2西寶生物發光（AE）平臺25-羥基維生素D抗體配對組合1與羅氏診斷的25-羥基維生素D試劑（電化學發光法）賦值的臨床樣本相關性R2在0.90左右，相關性較好。
3.2化學發光（AP）平臺：
3.2.1西寶生物發光（AP）平臺25-羥基維生素D抗體配對組合2與質譜法賦值的臨床樣本相關性R2在0.95左右，相關性良好；
3.2.2西寶生物發光（AP）平臺25-羥基維生素D抗體配對組合2與羅氏診斷的25-羥基維生素D試劑（電化學發光法）賦值的臨床樣本相關性R2＞0.90，相關性較好。
3.3熒光免疫層析平臺：
西寶生物熒光免疫層析平臺25-羥基維生素D抗體配對組合3與羅氏診斷25-羥基維生素D試劑（電化學發光法）賦值的臨床樣本相關性R2＞0.90，相關性較好。
4. 測試方案
4.1化學發光（AE）平臺-抗體配對組合1
樣本:樣品加樣量10ul；
試劑1：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；
試劑3：25-羥基維生素D解離液（發光專用1）（貨號：DCH0207B）/25-羥基維生素D解離液（發光專用2）（貨號：DCH0207A）
注釋：25-羥基維生素D解離液（發光專用1）（貨號：DCH0207B）對質譜法賦值臨床樣本效果較好；
25-羥基維生素D解離液（發光專用2）（貨號：DCH0207A）對羅氏診斷（電化學發光法）賦值臨床樣本效果較好；
反應條件：
第一步：10ul樣本+50ul試劑1+50ul試劑2+80ul試劑3混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入預激發液及激發液，進行測試。
測試使用發光儀器:科斯邁SMART 500S。
4.2化學發光（AP）平臺-抗體配對組合2：
樣本:樣品加樣量10ul/20ul；
試劑1：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；
試劑3：25-羥基維生素D解離液（發光專用1）（貨號：DCH0207B）/25-羥基維生素D解離液（發光專用2）（貨號：DCH0207A）
注釋：25-羥基維生素D解離液（發光專用1）（貨號：DCH0207B）對質譜法賦值臨床樣本效果較好；
25-羥基維生素D解離液（發光專用2）（貨號：DCH0207A）對羅氏診斷（電化學發光法）賦值臨床樣本效果較好；
反應條件：
第一步：10ul/20ul樣本+50ul試劑1+50ul試劑2+80ul試劑3混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，進行測試。
測試使用發光儀器:迎凱Shine i2900。
4.3熒光免疫層析平臺抗體配對組合3：
樣本:加樣量10ul；
反應條件：10ul樣品+100ul 25-羥基維生素D解離液（熒光層析專用）（貨號：DCH0207C）混勻（無需等待解離），上樣，反應時間（10min-15min）；
測試使用熒光儀器:和邁FIC-S100。
5.產品信息
產品名稱 | 貨號 | 推薦配對 |
25 羥基維生素 D（25-OH VD）抗體 | ECY4531B | 25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被羧基磁珠+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記吖啶酯（發光配對組合1） 25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被羧基磁珠+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記堿性磷酸酶（發光配對組合2） 25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記熒光微球+25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）劃膜（熒光配對組合3） |
25 羥基維生素 D（25-OH VD）抗體 | ECY4531C | |
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531B）包被羧基磁珠濃縮液 | DKY1333A | DKY1333A+ DKY1333B（AE化學發光） |
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）吖啶酯濃縮液 | DKY1333B | |
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記堿性磷酸酶濃縮液 | DKY1333C | DKY1333A+ DKY1333C（AP化學發光） |
25-羥基維生素D抗體（貨號：ECY4531C）標記熒光微球濃縮液 | DKY1333D | DKY1333A+ DKY1333D（免疫熒光層析） |
AMPPD 發光底物液（即用型） | DCD0517A | |
AMPPD 發光底物液（即用型） | DCD0517B | |
羧基磁性微球，1.5um | DEG0800C | |
時間分辨熒光微球，羧基（200nm） | AEG0786B | |
25-羥基維生素D解離液（發光專用1） | DCH0207B | 適合化學發光（質譜法賦值臨床樣本） |
25-羥基維生素D解離液（發光專用2） | DCH0207A | 適合化學發光（羅氏診斷電化學發光法樣本 ） |
25-羥基維生素D解離液（熒光層析專用） | DCH0207C | 適合免疫熒光層析平臺 |
目前，由于維生素D檢測的標準化工作剛剛起步，各種檢測方法間存在著明顯的結果差異，尤其是商業化方法以及不同實驗室的自建方法。
1.液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）作為小分子檢測的金標準，雖然特異性好、準確度高，但其通量小、前處理復雜、對設備和人員要求高，更重要的是出報告時間超過6小時，且無法當天出報告，因此難以廣泛使用。
2.主流化學發光廠家檢測維生素D的主要方法還有競爭法。
3.雙抗夾心法相較于競爭法在靈敏度、特異性和檢測范圍均有明顯優勢，使用小分子夾心法檢測維生素D近年得到了廠商和臨床端越來越多的認可。
西寶生物作為體外診斷上游原料供應商，除上述新開發的夾心法抗原抗體試劑原料，還能提供競爭法相關試劑.詳情如下：
西寶物料 | 產品 | 類型 | 規格 | 建議使用 |
EDD0425A | 25 羥基維生素 D（25-OH-VD3-BSA）抗原 | 包被 | 1mg | CLIA、LF （競爭法） |
ECY4531A | 25 羥基維生素 D（25-OH VD）抗體 | 標記 | 1mg | |
DCH0207B | 25-羥基維生素D解離液（發光專用1） | 100ml | ||
DCH0207A | 25-羥基維生素D解離液（發光專用2） | 100ml | ||
DCH0207C | 25-羥基維生素D解離液（熒光層析專用） | 100ml |
