【包裝規(guī)格】

【檢測(cè)原理和用途】

硫酸皮膚素（Dermatan sulfate，DS）屬于糖胺聚糖類，亦稱作硫酸軟骨素B，其結(jié)構(gòu)由β-艾杜糖醛酸-(1-3)-N-乙酰基-β-半乳糖胺-4硫酸的重復(fù)二糖單元構(gòu)成。DS分子具有顯著的負(fù)電荷特性，易于與蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)鍵結(jié)合，形成蛋白聚糖。在生物體內(nèi)，DS廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁中，發(fā)揮著細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)、抗凝血以及血管保護(hù)等生理功能和藥理作用。硫酸皮膚素已被應(yīng)用于治療骨關(guān)節(jié)炎和心血管疾病。在化妝品領(lǐng)域，DS被用于保濕、抗衰老以及改善皮膚健康。此外，DS在飲食補(bǔ)充劑中亦有應(yīng)用。本試劑盒利用硫酸皮膚素的特異性降解酶，將DS分解為不飽和糖醛酸，并在232nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生特異性光吸收，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中DS含量的精確測(cè)定。

【使用說明】

一、工前準(zhǔn)備

1.設(shè)備準(zhǔn)備

請(qǐng)事先準(zhǔn)備好酶標(biāo)儀、移液器、無菌離心管、溫箱等。

2.標(biāo)準(zhǔn)品工作液制備

取一支標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確加入1000μL稀釋液，混合均勻后形成500μg/ml的DS溶液，隨后通過倍比稀釋方法，制備獲得250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.3μg/ml、15.6μg/ml、7.8μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各500μl。

3.酶工作液制備

取酶，加入500μl稀釋液，輕輕混勻，室溫溶解10min，形成4×母液。-20℃可穩(wěn)定保存6個(gè)月。

使用時(shí)，將4×母液用稀釋液稀釋4倍，形成酶工作液。

4.樣品制備

用稀釋液溶解或稀釋樣品，必要時(shí)可通過離心和/或0.22μm過濾處理后獲得上清用于后續(xù)檢測(cè)，避免有不溶性物質(zhì)存在。調(diào)整樣品中的DS濃度至7~250 μg/mL范圍內(nèi)。

二、檢測(cè)步驟

1.預(yù)熱

將稀釋液和配制好的底物液于37℃保溫5min。酶標(biāo)儀開機(jī)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)檢測(cè)波長(zhǎng)至232 nm。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

（1）標(biāo)記好標(biāo)準(zhǔn)品的孔位，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔設(shè)置2重復(fù)，在標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)加入酶工作液，50μl/孔。

（2）分別取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，加入對(duì)應(yīng)標(biāo)記好的UV酶標(biāo)板孔內(nèi)，200μl/孔。

（3）立即讀取OD₂₃₂數(shù)值，記為OD_T0值。

（4）于37℃恒溫孵育30min。

（5）讀取第30min時(shí)的OD₂₃₂數(shù)值，記為OD_T1值。

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸，對(duì)應(yīng)?OD（OD_T1-OD_T0）值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，R²≥0.9900。

3.樣品測(cè)定

（1）UV酶標(biāo)板上標(biāo)記好樣品孔和溶劑對(duì)照孔。

（2）在樣品孔和對(duì)照孔內(nèi)加入酶工作液，50μl/孔。

（3）分別取200μl樣品和溶劑，加入樣品孔和溶劑對(duì)照孔內(nèi)，200 μl/孔。

（4）立即讀取OD232數(shù)值，記為ODT0值。

（5）于37℃恒溫孵育30min。

（6）讀取第30min時(shí)的OD232數(shù)值，記為ODT1值。

（7）計(jì)算?OD（ODT1-ODT0）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品中硫酸皮膚素的含量。

三、結(jié)果計(jì)算

Xi=d*(?OD-b)/a

式中：

Xi —— 樣品中的DS濃度（μg/ml）；

d—— 樣品稀釋倍數(shù)；

?OD——0min和30min的OD232差值；

a —— 標(biāo)準(zhǔn)方程式中的斜率a；

b —— 標(biāo)準(zhǔn)方程式中的截距b。