【檢測原理和用途】

硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate, CS）是一種糖胺聚糖，根據(jù)二糖單元硫酸化位點的不同可細分為CS-A、CS-B、CS-C、CS-D、CS-E、CS-F等十一種類型。牛、豬、雞等軟骨來源的CS以CS-A為主；鯊魚以CS-C為主；魚類、鯊魚和魷魚可得到CS-D；魷魚以CS-E為主。CS在角膜修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、保護軟骨、調(diào)節(jié)腫瘤生長、促進生物礦化和抗病毒等方面展現(xiàn)出生物活性，已被廣泛應(yīng)用于生物粘合劑、藥物遞送系統(tǒng)、細胞支架和表面涂層等，具有良好的生物相容性、可設(shè)計性等優(yōu)勢。本試劑盒利用硫酸軟骨素AC的特異性降解酶，將CS分解為不飽和糖醛酸，并在232nm波長處產(chǎn)生特異性光吸收，通過標準曲線法可實現(xiàn)對樣本中CS含量的精確測定。

【使用說明】

一、工前準備

1.設(shè)備準備

請事先準備好酶標儀、移液器、無菌離心管、溫箱等。

2.標準品工作液制備

取一支標準品，準確加入1000μL稀釋液，混合均勻后形成1000 μg/ml的CS溶液，隨后通過倍比稀釋方法，制備獲得1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.3μg/ml、15.6μg/ml、7.8μg/ml的標準品溶液，各500μl。

3.酶工作液制備

取酶，加入600μl稀釋液，輕輕混勻，室溫溶解10min，形成10×母液。將之分裝6支，100μl/支，-20℃可穩(wěn)定保存6個月。

使用時，將10×母液用稀釋液稀釋10倍（即每支加入900ul稀釋液），形成酶工作液。

4.樣品制備

用稀釋液溶解或稀釋樣品，必要時可通過離心和/或0.22μm過濾處理后獲得上清用于后續(xù)檢測，避免有不溶性物質(zhì)存在。調(diào)整樣品中的CS濃度至7~1000g/mL范圍內(nèi)。

二、 檢測步驟

1.預(yù)熱

將稀釋液和配制好的底物液于37℃保溫5min。酶標儀開機預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)檢測波長至232 nm。

2.標準曲線繪制

（1）標記好標準品的孔位，每個標準品孔設(shè)置2重復(fù)，在標準品孔內(nèi)加入酶工作液，50μl/孔。

（2）分別取各濃度的標準品工作液，加入對應(yīng)標記好的UV酶標板孔內(nèi)，200μl/孔。

（3）立即讀取OD₂₃₂數(shù)值，記為OD_T0值。

（4）于37℃恒溫孵育30min。

（5）讀取第30min時的OD₂₃₂數(shù)值，記為OD_T1值。

（6）以標準品濃度為x軸，對應(yīng)?OD（OD_T1-OD_T0）值為y軸，繪制標準曲線，R²≥0.9900。

3.樣品測定

（1）UV酶標板上標記好樣品孔和溶劑對照孔。

（2）在樣品孔和對照孔內(nèi)加入酶工作液，50μl/孔。

（3）分別取200μl樣品和溶劑，加入樣品孔和溶劑對照孔內(nèi)，200 μl/孔。

（4）立即讀取OD232數(shù)值，記為ODT0值。

（5）于37℃恒溫孵育30min。

（6）讀取第30min時的OD232數(shù)值，記為ODT1值。

（7）計算?OD（ODT1-ODT0）值，根據(jù)標準曲線和樣品稀釋倍數(shù)計算樣品中硫酸軟骨素AC的含量。

三、結(jié)果計算

Xi=d*(?OD-b)/a

式中：

Xi —— 樣品中的CS濃度（μg/ml）；

d—— 樣品稀釋倍數(shù)；

?OD—— 0min和30min的OD232差值；

a —— 標準方程式中的斜率a；

b —— 標準方程式中的截距b。