摘要：通過捕獲短壽命RNA分子，科學(xué)家們可以繪制出基因和控制它們的調(diào)控元件之間的關(guān)系。
人類基因組包含大約23000個基因，但在任何給定時間，這些基因中只有一小部分在細(xì)胞內(nèi)被激活。控制基因表達(dá)的調(diào)控元件的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)包括基因組中稱為增強子的區(qū)域，這些區(qū)域通常位于遠(yuǎn)離它們所調(diào)節(jié)的基因的地方。
這種距離使得繪制基因和增強子之間復(fù)雜的相互作用圖譜變得困難。為了克服這個問題，麻省理工學(xué)院的研究人員發(fā)明了一種新技術(shù)，使他們能夠觀察細(xì)胞中基因和增強子激活的時間。當(dāng)一個基因與一個特定的增強子幾乎同時被激活時，它強烈表明該增強子控制著該基因。
在不同類型的細(xì)胞中，更多地了解哪些增強子控制哪些基因，可以幫助研究人員確定遺傳疾病的潛在藥物靶點?；蚪M研究已經(jīng)確定了許多與多種疾病有關(guān)的非蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的突變。這些可能是未知的增強劑嗎?
“當(dāng)人們開始使用基因技術(shù)來識別具有疾病信息的染色體區(qū)域時，大多數(shù)這些位點并不對應(yīng)于基因。我們懷疑它們對應(yīng)于這些增強子，這些增強子可能離啟動子很遠(yuǎn)，所以能夠識別這些增強子是非常重要的，”麻省理工學(xué)院名譽教授、麻省理工學(xué)院科赫綜合癌癥研究所成員Phillip Sharp說。
Sharp是今天發(fā)表在《Nature》雜志上的這項新研究的資深作者。麻省理工學(xué)院研究助理D.B. Jay Mahat是該論文的主要作者。
圖1 單細(xì)胞新生RNA測序揭示協(xié)調(diào)的全球轉(zhuǎn)錄
尋找eRNA
不到2%的人類基因組是由蛋白質(zhì)編碼基因組成的。基因組的其余部分包括許多控制這些基因何時以及如何表達(dá)的元素。增強子被認(rèn)為是在45年前發(fā)現(xiàn)的，它通過與基因啟動子區(qū)域的物理接觸，短暫地形成一個復(fù)合物，從而開啟基因。
最近，在2010年，研究人員發(fā)現(xiàn)這些增強子被轉(zhuǎn)錄成RNA分子，稱為增強子RNA或eRNA。科學(xué)家們懷疑，當(dāng)增強子與靶基因積極相互作用時，這種轉(zhuǎn)錄就會發(fā)生。這就提出了一種可能性，即測量eRNA轉(zhuǎn)錄水平可以幫助研究人員確定增強子何時活躍，以及它針對哪些基因。
Mahat說:“這些信息對于理解細(xì)胞如何發(fā)育、理解癌癥如何改變它們的調(diào)控程序、激活導(dǎo)致去分化和轉(zhuǎn)移性生長的過程非常重要。”
然而，由于eRNA產(chǎn)生的數(shù)量非常少，并且在細(xì)胞中不能持續(xù)很長時間，因此這種繪制已被證明是困難的。此外，eRNA缺乏一種被稱為poly-A尾巴的修飾，這是大多數(shù)技術(shù)用來將RNA從細(xì)胞中拉出的“鉤子”。
捕獲eRNA的一種方法是向細(xì)胞中添加一個核苷酸，該核苷酸在與RNA結(jié)合時停止轉(zhuǎn)錄。這些核苷酸還含有一種叫做生物素的標(biāo)簽，可以用來將RNA從細(xì)胞中撈出來。然而，目前的技術(shù)只適用于大量細(xì)胞，并不能提供單個細(xì)胞的信息。
在集思集想捕獲eRNA的新方法時，Mahat和Sharp考慮使用點擊化學(xué)，一種可以將兩個分子連接在一起的技術(shù)，如果它們每個都被標(biāo)記上可以一起反應(yīng)的“點擊手柄”。
研究人員設(shè)計了一鍵式手柄標(biāo)記的核苷酸，一旦這些核苷酸被整合到生長的eRNA鏈中，這些鏈就可以用包含互補手柄的標(biāo)簽打撈出來。這使得研究人員能夠捕獲eRNA，然后對其進行純化、擴增和測序。每一步都會丟失一些RNA，但Mahat估計他們可以成功地從一個給定的細(xì)胞中提取出大約10%的eRNA。
圖2 單細(xì)胞新生RNA測序的示意圖和基準(zhǔn)
利用這項技術(shù)，研究人員獲得了細(xì)胞中在給定時間內(nèi)活躍轉(zhuǎn)錄的增強子和基因的快照。
“你希望能夠確定，在每個細(xì)胞中，從調(diào)控元件和相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活。這必須在單個細(xì)胞中完成，因為這是你可以檢測調(diào)節(jié)元件和基因之間的同步或異步的地方，”Mahat說。
基因表達(dá)的時機
研究人員在小鼠胚胎干細(xì)胞中展示了他們的技術(shù)，他們發(fā)現(xiàn)他們可以根據(jù)RNA鏈的長度和聚合酶(負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的酶)的速度——也就是說，聚合酶每秒轉(zhuǎn)錄的距離——計算出特定區(qū)域開始轉(zhuǎn)錄的大致時間。這使他們能夠確定哪些基因和增強子在大約同一時間被轉(zhuǎn)錄。
研究人員使用這種方法比以前更詳細(xì)地確定細(xì)胞周期基因表達(dá)的時間。他們還能夠確認(rèn)幾組已知的基因增強子對，并生成了一個大約5萬個可能的增強子基因?qū)Φ牧斜恚麄儸F(xiàn)在可以嘗試驗證這些基因?qū)Α?/div>
圖1 單細(xì)胞新生RNA測序揭示協(xié)調(diào)的全球轉(zhuǎn)錄
了解哪些增強子控制哪些基因，對于開發(fā)針對遺傳基礎(chǔ)疾病的新療法將證明是有價值的。去年，美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration)批準(zhǔn)了首個治療鐮狀細(xì)胞性貧血的基因療法，該療法通過干擾一種增強劑來激活胎兒珠蛋白基因，從而減少鐮狀血細(xì)胞的產(chǎn)生。
麻省理工學(xué)院的研究小組現(xiàn)在正將這種方法應(yīng)用于其他類型的細(xì)胞，重點是自身免疫性疾病。他們正在與波士頓兒童醫(yī)院的研究人員合作，探索與狼瘡有關(guān)的免疫細(xì)胞突變，其中許多是在基因組的非編碼區(qū)域發(fā)現(xiàn)的。
“目前還不清楚哪些基因受到這些突變的影響，所以我們開始梳理這些假定的增強子可能調(diào)節(jié)的基因，以及這些增強子在哪些細(xì)胞類型中是活躍的，”Mahat說?！斑@是一個創(chuàng)建基因到增強子圖譜的工具，這是理解生物學(xué)的基礎(chǔ)，也是理解疾病的基礎(chǔ)?！?/div>
這項研究的發(fā)現(xiàn)也為Sharp最近與麻省理工學(xué)院教授理查德·楊和Arup Chakraborty共同提出的一個理論提供了證據(jù)，該理論認(rèn)為基因轉(zhuǎn)錄是由被稱為冷凝物的無膜液滴控制的。這些凝聚物是由大量的酶和RNA組成的，Sharp認(rèn)為其中可能包括在增強子位點產(chǎn)生的eRNA。
“我們認(rèn)為增強子和啟動子之間的交流是一種凝聚型的瞬態(tài)結(jié)構(gòu)，RNA是其中的一部分。這是一項重要的工作，有助于理解來自增強子的RNA是如何被激活的。
這項研究由美國國家癌癥研究所、美國國立衛(wèi)生研究院和祖母綠基金會博士后過渡獎資助。
參考資料
[1] Single-cell nascent RNA sequencing unveils coordinated global transcription
摘要：通過捕獲短壽命RNA分子，科學(xué)家們可以繪制出基因和控制它們的調(diào)控元件之間的關(guān)系。
人類基因組包含大約23000個基因，但在任何給定時間，這些基因中只有一小部分在細(xì)胞內(nèi)被激活。控制基因表達(dá)的調(diào)控元件的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)包括基因組中稱為增強子的區(qū)域，這些區(qū)域通常位于遠(yuǎn)離它們所調(diào)節(jié)的基因的地方。
這種距離使得繪制基因和增強子之間復(fù)雜的相互作用圖譜變得困難。為了克服這個問題，麻省理工學(xué)院的研究人員發(fā)明了一種新技術(shù)，使他們能夠觀察細(xì)胞中基因和增強子激活的時間。當(dāng)一個基因與一個特定的增強子幾乎同時被激活時，它強烈表明該增強子控制著該基因。
在不同類型的細(xì)胞中，更多地了解哪些增強子控制哪些基因，可以幫助研究人員確定遺傳疾病的潛在藥物靶點?；蚪M研究已經(jīng)確定了許多與多種疾病有關(guān)的非蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的突變。這些可能是未知的增強劑嗎?
“當(dāng)人們開始使用基因技術(shù)來識別具有疾病信息的染色體區(qū)域時，大多數(shù)這些位點并不對應(yīng)于基因。我們懷疑它們對應(yīng)于這些增強子，這些增強子可能離啟動子很遠(yuǎn)，所以能夠識別這些增強子是非常重要的，”麻省理工學(xué)院名譽教授、麻省理工學(xué)院科赫綜合癌癥研究所成員Phillip Sharp說。
Sharp是今天發(fā)表在《Nature》雜志上的這項新研究的資深作者。麻省理工學(xué)院研究助理D.B. Jay Mahat是該論文的主要作者。
圖1 單細(xì)胞新生RNA測序揭示協(xié)調(diào)的全球轉(zhuǎn)錄
尋找eRNA
不到2%的人類基因組是由蛋白質(zhì)編碼基因組成的。基因組的其余部分包括許多控制這些基因何時以及如何表達(dá)的元素。增強子被認(rèn)為是在45年前發(fā)現(xiàn)的，它通過與基因啟動子區(qū)域的物理接觸，短暫地形成一個復(fù)合物，從而開啟基因。
最近，在2010年，研究人員發(fā)現(xiàn)這些增強子被轉(zhuǎn)錄成RNA分子，稱為增強子RNA或eRNA?？茖W(xué)家們懷疑，當(dāng)增強子與靶基因積極相互作用時，這種轉(zhuǎn)錄就會發(fā)生。這就提出了一種可能性，即測量eRNA轉(zhuǎn)錄水平可以幫助研究人員確定增強子何時活躍，以及它針對哪些基因。
Mahat說:“這些信息對于理解細(xì)胞如何發(fā)育、理解癌癥如何改變它們的調(diào)控程序、激活導(dǎo)致去分化和轉(zhuǎn)移性生長的過程非常重要?！?/div>
圖2 單細(xì)胞新生RNA測序的示意圖和基準(zhǔn)
然而，由于eRNA產(chǎn)生的數(shù)量非常少，并且在細(xì)胞中不能持續(xù)很長時間，因此這種繪制已被證明是困難的。此外，eRNA缺乏一種被稱為poly-A尾巴的修飾，這是大多數(shù)技術(shù)用來將RNA從細(xì)胞中拉出的“鉤子”。
捕獲eRNA的一種方法是向細(xì)胞中添加一個核苷酸，該核苷酸在與RNA結(jié)合時停止轉(zhuǎn)錄。這些核苷酸還含有一種叫做生物素的標(biāo)簽，可以用來將RNA從細(xì)胞中撈出來。然而，目前的技術(shù)只適用于大量細(xì)胞，并不能提供單個細(xì)胞的信息。
在集思集想捕獲eRNA的新方法時，Mahat和Sharp考慮使用點擊化學(xué)，一種可以將兩個分子連接在一起的技術(shù)，如果它們每個都被標(biāo)記上可以一起反應(yīng)的“點擊手柄”。
研究人員設(shè)計了一鍵式手柄標(biāo)記的核苷酸，一旦這些核苷酸被整合到生長的eRNA鏈中，這些鏈就可以用包含互補手柄的標(biāo)簽打撈出來。這使得研究人員能夠捕獲eRNA，然后對其進行純化、擴增和測序。每一步都會丟失一些RNA，但Mahat估計他們可以成功地從一個給定的細(xì)胞中提取出大約10%的eRNA。
圖2 單細(xì)胞新生RNA測序的示意圖和基準(zhǔn)
利用這項技術(shù)，研究人員獲得了細(xì)胞中在給定時間內(nèi)活躍轉(zhuǎn)錄的增強子和基因的快照。
“你希望能夠確定，在每個細(xì)胞中，從調(diào)控元件和相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活。這必須在單個細(xì)胞中完成，因為這是你可以檢測調(diào)節(jié)元件和基因之間的同步或異步的地方，”Mahat說。
基因表達(dá)的時機
研究人員在小鼠胚胎干細(xì)胞中展示了他們的技術(shù)，他們發(fā)現(xiàn)他們可以根據(jù)RNA鏈的長度和聚合酶(負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的酶)的速度——也就是說，聚合酶每秒轉(zhuǎn)錄的距離——計算出特定區(qū)域開始轉(zhuǎn)錄的大致時間。這使他們能夠確定哪些基因和增強子在大約同一時間被轉(zhuǎn)錄。
研究人員使用這種方法比以前更詳細(xì)地確定細(xì)胞周期基因表達(dá)的時間。他們還能夠確認(rèn)幾組已知的基因增強子對，并生成了一個大約5萬個可能的增強子基因?qū)Φ牧斜?，他們現(xiàn)在可以嘗試驗證這些基因?qū)Α?/div>
了解哪些增強子控制哪些基因，對于開發(fā)針對遺傳基礎(chǔ)疾病的新療法將證明是有價值的。去年，美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration)批準(zhǔn)了首個治療鐮狀細(xì)胞性貧血的基因療法，該療法通過干擾一種增強劑來激活胎兒珠蛋白基因，從而減少鐮狀血細(xì)胞的產(chǎn)生。
麻省理工學(xué)院的研究小組現(xiàn)在正將這種方法應(yīng)用于其他類型的細(xì)胞，重點是自身免疫性疾病。他們正在與波士頓兒童醫(yī)院的研究人員合作，探索與狼瘡有關(guān)的免疫細(xì)胞突變，其中許多是在基因組的非編碼區(qū)域發(fā)現(xiàn)的。
“目前還不清楚哪些基因受到這些突變的影響，所以我們開始梳理這些假定的增強子可能調(diào)節(jié)的基因，以及這些增強子在哪些細(xì)胞類型中是活躍的，”Mahat說?！斑@是一個創(chuàng)建基因到增強子圖譜的工具，這是理解生物學(xué)的基礎(chǔ)，也是理解疾病的基礎(chǔ)?！?/div>
這項研究的發(fā)現(xiàn)也為Sharp最近與麻省理工學(xué)院教授理查德·楊和Arup Chakraborty共同提出的一個理論提供了證據(jù)，該理論認(rèn)為基因轉(zhuǎn)錄是由被稱為冷凝物的無膜液滴控制的。這些凝聚物是由大量的酶和RNA組成的，Sharp認(rèn)為其中可能包括在增強子位點產(chǎn)生的eRNA。
“我們認(rèn)為增強子和啟動子之間的交流是一種凝聚型的瞬態(tài)結(jié)構(gòu)，RNA是其中的一部分。這是一項重要的工作，有助于理解來自增強子的RNA是如何被激活的。
這項研究由美國國家癌癥研究所、美國國立衛(wèi)生研究院和祖母綠基金會博士后過渡獎資助。
參考資料
[1] Single-cell nascent RNA sequencing unveils coordinated global transcription
