一直以來(lái)大家都默認(rèn)基因都是在染色體上，染色體外DNA（ecDNA）這一概念的出現(xiàn)可以說(shuō)是顛覆了大家的傳統(tǒng)認(rèn)知，原來(lái)研究了半天，竟是搞錯(cuò)了方向，癌基因其實(shí)并不在我們關(guān)注的染色體上。由此，癌癥研究打開(kāi)了一扇新大門。

ecDNA是一種存在于染色體外，高度開(kāi)放的DNA 顆粒，普遍存在于人類癌細(xì)胞中。因其能通過(guò)基因擴(kuò)增和改變基因調(diào)控來(lái)介導(dǎo)癌基因的高表達(dá)，被認(rèn)為與腫瘤的異質(zhì)性和耐藥性相關(guān)。

編碼致癌基因的ecDNA是癌癥基因組的普遍特征，也是癌癥進(jìn)展的一個(gè)強(qiáng)有力的驅(qū)動(dòng)因素。ecDNA是共價(jià)閉合雙鏈，大小從100千堿基到幾兆堿基不等。因缺乏著絲粒，ecDNA在細(xì)胞分裂過(guò)程中會(huì)隨機(jī)分布于子細(xì)胞，這就方便了其快速積累，而且可以重新整合到染色體中，因此也可作為某些染色體擴(kuò)增的前體。ecDNA具有更高的染色質(zhì)可及性，但卻缺乏更高的染色質(zhì)致密性，且包含內(nèi)源性致癌基因增強(qiáng)子元件，這表明癌基因擴(kuò)增子可能是通過(guò)調(diào)控依賴性來(lái)擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄的。因其本身存在于染色體外，目前對(duì)其細(xì)胞核中的空間還不清楚。ecDNA在細(xì)胞分裂期間或DNA損傷后會(huì)相互聚集，但其聚集后生物學(xué)后果目前還不甚了解。

11月24日，斯坦福大學(xué)HowardChang教授團(tuán)隊(duì)在《Nature》發(fā)表了題為“ ecDNAhubs drive cooperative intermolecular oncogene expression”的論文，他們研究了致癌ecDNA的細(xì)胞核空間、表觀遺傳因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，發(fā)現(xiàn)聚集在間期細(xì)胞核中的ecDNA可以“抱團(tuán)行動(dòng)”，驅(qū)動(dòng)分子間增強(qiáng)子信號(hào)來(lái)促使癌基因表達(dá)擴(kuò)增。

   

ecDNA促進(jìn)癌癥基因表達(dá)    

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)DNA熒光原位雜交（FISH）來(lái)觀察間期細(xì)胞核中的ecDNA的聚集點(diǎn)，包括前列腺癌細(xì)胞系PC3（MYC擴(kuò)增）、結(jié)直腸癌細(xì)胞系COLO320-DM（MYC擴(kuò)增）、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系HK359（EGFR擴(kuò)增）和胃癌細(xì)胞系SNU16（MYC和FGFR2擴(kuò)增）。結(jié)果顯示，所有ecDNA陽(yáng)性癌細(xì)胞中，除去有數(shù)十到數(shù)百個(gè)單獨(dú)的ecDNA分子，ecDNAFISH基本都集中在間期細(xì)胞核中，這表明ecDNA彼此之間有強(qiáng)烈的聚集，研究團(tuán)隊(duì)將其稱為ecDNA中心。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，在具有不同癌基因擴(kuò)增的各種癌癥類型和原發(fā)性腫瘤中均存在ecDNA聚集。

研究人員利用DNA和新生RNAFISH，在PC3和COLO320-DM細(xì)胞中觀察到活躍轉(zhuǎn)錄的MYC等位基因，并計(jì)算出每個(gè)ecDNA分子的MYC轉(zhuǎn)錄概率。大多數(shù)新生MYCmRNA轉(zhuǎn)錄本來(lái)自ecDNA中心，而不是來(lái)自染色體。此外，與單子ecDNA相比，ecDNA中心的轉(zhuǎn)錄活性更高。因此，ecDNAs中心聚集時(shí)，每個(gè)ecDNA分子更有可能轉(zhuǎn)錄致癌基因    

   

BRD4連接ecDNA中心和轉(zhuǎn)錄    

癌基因MYC包含MYC和漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（PVT1，拷貝數(shù)擴(kuò)增相關(guān)的lncRNA，已知的癌癥相關(guān)區(qū)域），兩側(cè)是由組蛋白H3乙酰化賴氨酸27（H3K27ac）和BET蛋白（如BRD4）為標(biāo)記的超級(jí)增強(qiáng)因子。為了檢查活細(xì)胞中的MYCecDNA，研究人員在COLO320-DM細(xì)胞的MYCecDNA中插入了Tet-operator（TetO）陣列，并用Tet-eGFP標(biāo)記了ecDNA，以盡量減少GFP二聚化。活細(xì)胞成像顯示，有多個(gè)動(dòng)態(tài)核病灶對(duì)應(yīng)ecDNA聚集。內(nèi)源性BRD4的表位標(biāo)記顯示，BRD4在TetO標(biāo)記的ecDNA中心高度富集。通過(guò)對(duì)H3K27ac和BRD4進(jìn)行測(cè)序和染色質(zhì)免疫沉淀來(lái)分析染色質(zhì)，結(jié)果顯示標(biāo)記活性H3K27ac的ecDNA也被BRD4占據(jù)。    

為了確定BET蛋白在ecDNA相關(guān)轉(zhuǎn)錄中的作用，研究人員重點(diǎn)研究了同源的結(jié)直腸癌細(xì)胞系COLO320-DM（MYCecDNA）和COLO320-HSR（來(lái)源于同一患者腫瘤）。TetO-GFPCOLO320-DM細(xì)胞中進(jìn)行的活細(xì)胞成像顯示，ecDNA中心在有絲分裂過(guò)程中被分解成更小的顆粒。分解后，ecDNAs又再次聚集成大中心。值得注意的是，有絲分裂后，ecDNA中心重新聚集被JQ1（BRD4抑制劑）阻斷。結(jié)果表明，在COLO320-DM細(xì)胞中，ecDNA中心的形成、維持和腫瘤基因轉(zhuǎn)錄對(duì)BET蛋白H3K27ac相互作用有獨(dú)特的依賴性。    

   

ecDNA中心反式激活    

為了將ecDNA結(jié)構(gòu)與MYC轉(zhuǎn)錄調(diào)控聯(lián)系起來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)使用五種正交方法重建了COLO320-DM的ecDNA，報(bào)告了目前已知的組裝的大的ecDNA結(jié)構(gòu)，包含PVT1-MYC融合、標(biāo)準(zhǔn)MYC序列和來(lái)自多個(gè)染色體起源的序列（6、8、13和16號(hào)染色體）的多個(gè)拷貝，并且利用DNA FISH驗(yàn)證了PLUT、PCAT1和MYC基因在重建預(yù)測(cè)的ecDNA上的共定位。    

研究團(tuán)隊(duì)在COLO320-DM細(xì)胞中觀察到了PVT1啟動(dòng)子處的強(qiáng)BRD4結(jié)合，但在COLO320-DMecDNA細(xì)胞中未觀察到。因PVT1啟動(dòng)子能被MYC激活，研究團(tuán)隊(duì)又假設(shè)PVT1-MYC融合可實(shí)現(xiàn)MYC表達(dá)的正反饋，避免PVT1和MYC啟動(dòng)子之間的過(guò)度表達(dá)，但在幾種人類癌癥中觀察到了PVT1重排和基因融合并驅(qū)動(dòng)基因過(guò)度表達(dá)。    

接下來(lái)，研究人員確定了與癌基因高表達(dá)相關(guān)的ecDNA調(diào)控元件。72049個(gè)來(lái)自COLO320-DM和COLO320-HSR細(xì)胞的配對(duì)單細(xì)胞ATAC–seq和RNA-seq，經(jīng)校正MYC拷貝數(shù)后確定了47個(gè)與高M(jìn)YC表達(dá)相關(guān)的ecDNA調(diào)控元件，而目前驅(qū)動(dòng)ecDNA上MYC癌基因表達(dá)的PVT1啟動(dòng)子（PVT1p）在ecDNA中心內(nèi)接受了廣泛的組合增強(qiáng)子輸入。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，分子間增強(qiáng)子-啟動(dòng)子在ecDNA中心激活，同時(shí)研究人員證實(shí)PVT1p作為一種DNA元件，能夠反式激活ecDNA中心。    

   

ecDNA間的分子調(diào)控    

研究人員進(jìn)一步研究了分子間增強(qiáng)子-基因相互作用是如何進(jìn)行精確定位和干擾。以人胃癌細(xì)胞系SNU16為研究對(duì)象，其包含8號(hào)和11號(hào)染色體的MYC擴(kuò)增子和10號(hào)染色體的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（FGFR2）擴(kuò)增子。H3K27ac的染色質(zhì)免疫沉淀和測(cè)序顯示FGFR2和MYCecDNA之間存在分子間接觸，并富集了焦點(diǎn)相互作用。CRISPR干擾（CRISPRi）靶向候選調(diào)控元件確定了與MYC或FGFR2在順式和反式表達(dá)相關(guān)的功能元件。    

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)GFR2和MYCecDNA已被共同選擇，因此這兩個(gè)擴(kuò)增子上的增強(qiáng)子可協(xié)同激活MYC表達(dá)。MYC蛋白繼而激活FGFR2表達(dá)。順式和反式調(diào)控元件之間幾乎沒(méi)有重疊，表明分子間增強(qiáng)子元件是直接修飾反式基因表達(dá)，而非通過(guò)下游效應(yīng)。癌癥類型中的分子間ecDNA的相互作用評(píng)估顯示，ecDNA中心的分子間增強(qiáng)子-基因激活發(fā)生在不同的腫瘤基因位點(diǎn)和多種癌癥類型。    

   

綜上所述，上述研究顯示ecDNA“抱團(tuán)行動(dòng)”促進(jìn)了新的分子間增強(qiáng)子-基因相互作用和癌基因過(guò)表達(dá)，且可以發(fā)生在不同的腫瘤基因位點(diǎn)和多種癌癥類型中。與傳統(tǒng)的順式染色體轉(zhuǎn)錄不同，ecDNA中心反式調(diào)控能夠?qū)崿F(xiàn)分子間轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這對(duì)如何實(shí)現(xiàn)更好的癌基因轉(zhuǎn)錄具有重要的啟示。